{:en}Quoted from WHO, Indonesia is one of the tropical countries affected by the Dengue Virus (DENV). The emerging dengue vectors have four antigenically distinct serotypes. The four dengue virus serotypes were DENV-1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4. Dengue virus is transmitted by Aedes aegypti and Aedes albopictus mosquitoes. Dengue virus is transmitted through the bite of a female Aedes mosquito that occurs when a mosquito sucks the blood of a person infected with the dengue virus and the mosquito bites another person. Clinical symptoms include Dengue Hemorrhagic Fever (DHF) and Dengue Shock Syndrome (DSS). There are approximately 100 million cases of Dengue Fever (DF), 500,000 cases of DHF and 25,000 deaths reported annually worldwide. Therefore, further research is needed on this dengue virus.
Dengue virus is an RNA virus that can be identified using the Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) and Polymerase Chain Reaction (PCR) methods. The success of RT-PCR and PCR is determined by the RNA extraction process; with the right precipitation solvent to obtain high purity RNA. The solvents used were Isopropanol, DMSO, 96% Ethanol, Methanol, Acetone-Methanol (1:1), DMF, and distilled water. In this study, TRIzol was used as a method of RNA extraction in dengue virus DENV 1 Surabaya Genbank: AB915377.
RNA extraction using the TRIzol method used the TRIZol reagent consisting of phenol monophase solution and guanidium isocyanate (Rio et al., 2010). DENV-1 sample was dissolved with TRIZol reagent then chloroform was added to cause phase separation. The organic phase contains protein; DNA is at the interface and the clear phase contains RNA. The clear phase was transferred to a new tube and then added the precipitation solution, namely: isopropanol, DMSO, 96% ethanol, methanol, methanol acetone (1: 1), DMF, and distilled water. In solution, guanidium (NH2) 2C = NH2 + from the TRIzol reagent neutralizes the negative charge on the PO43- group of nucleic acids and makes the nucleic acids hydrophobic and less soluble in water so that they experience precipitation.
Precipitation solvents which have a low dielectric constant have the ability to support the interaction between guanidium and phosphate ions so that the nucleic acids become less hydrophilic and precipitate. RNA purity was determined by measuring the absorbance at a ratio of 260/280 nm with a nano drop spectrophotometer. In this study, the absorbance of RNA with isopropanol precipitation solvent was 1.78, DMSO was 1.36, 96% ethanol was 1.54, methanol was 1.01, acetone-methanol (1: 1) was 1.81, DMF was 1.70, and distilled water is 1.40.
Pure RNA has an absorbance value of 1.8 – 2.1 (Farrel., 2005). Pure RNA was obtained in the isolation process with acetone-methanol (1: 1) precipitation solvent with an absorbance value of 1.81. The RNA isolate that has been obtained is then reversed transcription with RT-PCR to obtain c-DNA (complementary DNA) and then amplified. The amplified c-DNA was then electrophoresed with agarose gel and visualized using a UV Trans-illuminator.
The dengue virus is carried by female mosquitoes of the Aedes aegypti and Aedes albopictus species. This viral RNA can be identified by using the Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) and Polymerase Chain Reaction (PCR) methods. The modification of the RNA isolation method from DENV-1 with the TRIzol method is expected to produce high quality RNA. The effect of precipitation solvents which have a low dielectric constant makes nucleic acids less hydrophilic and precipitates. The good quality of RNA can be seen with the high intensity of the DNA band produced and the low stain intensity. From the research, pure RNA was obtained in the isolation process with acetone-methanol (1: 1) precipitation solvent with an absorbance value of 1.81. So, from this study it was reported that the acetone-methanol (1: 1) precipitation solvent was the best solvent for precipitation. (*)
Author : Teguh Hari Sucipto
translator : Ausie
Source : http://news.unair.ac.id/2020/10/08/pengaruh-modifikasi-presipitan-terhadap-kemurnian-rna-virus-dengue/{:}{:id}Dikutip dari WHO, Indonesia adalah salah satu negara tropis yang terkena dampak Virus Dengue (DENV). vektor-vektor dengue yang muncul memiliki empat serotipe yang berbeda secara antigenik. Empat serotipe virus dengue meliputi DENV-1, DENV-2, DENV-3 dan DENV-4. Virus dengue ditularkan oleh nyamuk Aedes aegypti dan Aedes albopictus. Penularan virus dengue melalui gigitan nyamuk betina Aedes yang terjadi ketika nyamuk menghisap darah orang yang terinfeksi virus dengue dan nyamuk tersebut menggigit orang lain. Gejala klinis meliputi Dengue Hemorrhagic Fever (DHF) dan Dengue Shock Syndrome (DSS). Hal ini menyebabkan sekitar 100 juta kasus Demam Berdarah (DF), 500.000 kasus DHF serta 25.000 kematian dilaporkan setiap tahun di seluruh dunia. Oleh karena itu, diperlukan penelitian lebih lanjut tentang virus dengue.
Virus dengue merupakan virus RNA yang bisa diidentifiksi dengan metode Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) dan Polymerase Chain Reaction (PCR). keberhasilan RT-PCR dan PCR ditentukan oleh proses ekstraksi RNA dengan pelarut presipitasi yang tepat, untuk mendapatkan RNA dengan kemurnian tinggi. Pelarut yang digunakan adalah Isopropanol, DMSO, Etanol 96%, Metanol, Asetone-Metanol (1:1), DMF, air destilasi. Pada penelitian ini, digunakan TRIzol sebagai metode ekstraksi RNA pada virus dengue DENV 1 Surabaya Genbank: AB915377.
Esktraksi RNA dengan metode TRIzol menggunakan reagen TRIZol yang terdiri dari larutan monofase fenol dan guanidium isosianat (Rio et al., 2010). Sampel DENV-1 dilarutkan dengan reagen TRIZol kemudian ditambahkan kloroform sehingga terjadi pemisahan fase. Fase organik mengandung protein, DNA berada di interface dan fase jernih mengandung RNA. Fasa jernih dipindahkan ke tube baru dan kemudian ditambahkan larutan presipitasi yaitu: isopropanol, DMSO, etanol 96%, metanol, aseton metanol (1:1), DMF, dan air destilasi. Dalam larutan, guanidium (NH2)2C=NH2+ dari reagen TRIzol menetralkan muatan negatif pada gugus PO43- dari asam nukleat dan menjadikan asam nukleat bersifat hidrofob dan kurang larut dalam air sehingga mengalami presipitasi.
Pelarut presispitasi yang memiliki konstanta dielektrik rendah memiliki kemampuan untuk mendukung interaksi antara ion guanidium dan fosfat sehingga asam nukleat menjadi kurang hidrofil dan mengendap. Kemurnian RNA ditentukan dengan mengukur absorbansi pada rasio 260/280 nm dengan spektrofotometer nanodrop. Pada penelitian ini absorbansi RNA dengan pelarut presipitasi isopropanol adalah 1,78, DMSO adalah 1,36, etanol 96% adalah 1,54, metanol adalah 1,01, aseton-metanol (1:1) adalah 1,81, DMF adalah 1,70, dan air destilasi adalah 1,40.
RNA murni memiliki nilai absorbansi sebesar 1.8 – 2.1 (Farrel., 2005). RNA murni didapatkan pada proses isolasi dengan pelarut presipitasi aseton-metanol (1:1) dengan nilai absorbansi sebesar 1,81. Isolat RNA yang telah didapat kemudian direverse transkripsi dengan RT-PCR untuk mendapatkan c-DNA (complementary DNA) dan selanjutnya diamplifikasi. c-DNA hasil amplifikasi kemudian dielektroforesis dengan gel agarosa dan divisualisasi dengan menggunakan Trans-illuminator UV.
Virus dengue dibawa oleh nyamuk betina dari spesies Aedes aegypti dan Aedes albopictus. RNA virus ini, dapat diidentifiksi dengan metode Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) dan Polymerase Chain Reaction (PCR). Modifikasi metode isolasi RNA dari DENV-1 dengan metode TRIzol diharapkan dapat menghasilkan RNA yang berkualitas. Pengaruh pelarut presipitasi yang memiliki konstanta dielektrik rendah membuat asam nukleat menjadi kurang hidrofil dan mengendap. Kualitas RNA yang baik dapat dilihat dengan intensitas tinggi pita DNA yang dihasilkan dan intensitas noda yang rendah. Dari penelitian, RNA murni didapatkan pada proses isolasi dengan pelarut presipitasi aseton-metanol (1:1) dengan nilai absorbansi sebesar 1,81. Jadi, dari penelitian ini dilaporkan pelarut persipitasi aseton-metanol (1:1) merupakan pelarut presipitasi terbaik. (*)
Penulis: Teguh Hari Sucipto
Informasi detail tentang artikel ilmiah ini dapat dilihat di: https://e-journal.unair.ac.id/MKH/article/view/22311{:}
