{:en}

Several viruses that are transmitted through mosquitoes include Dengue virus (DENV), Japanese encephalitis virus (JEV), West Nile virus (WNV), and Zika virus (ZIKV) belonging to the Flavivirus genus and family Flaviviridae. Among them, DENV causes the most serious health problems in the world, in terms of the number of patients and the fatality rate. Infections caused by one of the DENV serotypes (1-4) cause Dengue fever (DF), Dengue hemorrhagic fever (DHF) or Dengue shock syndrome (DSS). Every year, at least 390 million dengue infections are recorded with 100 million people showing symptoms and 21,000 deaths worldwide.

One of the hypothesized mechanisms of the risk of an increase in severity due to DENV infection is antibody-dependent enhancement (ADE), which is where DENV antibodies that are already present in a person's body both caused by primary infection and due to vaccination will facilitate Fc-receptor positive cells such as macrophages when further dengue infection. Thus, DENV antibodies can play two conflicting activities, namely neutralization and ADE. Neutralization suppresses viremia resulting in a defense against DENV infection. While ADE increases viremia, which is associated with an increase in the severity of dengue infection. This phenomenon is likely to increase the risk of increasing severity in the event of Dengue infection in seronegative persons who have received the CYD-TDV vaccination, as the only currently licensed Dengue vaccine. In addition, ZIKV antibodies were also reported to be proven to increase dengue infection in vitro and vice versa. The presence of ADE complicates the pathogenesis of Dengue, a problem in itself for the development of an effective Dengue vaccine, as well as for the manufacture of prophylactic or therapeutic antibodies.

The dengue virus genome encodes three structural proteins namely capsid [C], premembrane/membrane [prM/M], and envelope [E] as well as seven non-structural proteins). Viral particles accumulate in the lumen of the endoplasmic reticulum, where the nucleocapsid (viral RNA complexes with protein C) is incorporated into a lipid bilayer containing the proteins prM and E. Due to the traffic of immature virus particles through the trans-Golgi network, a serine protease (furin) from the host cleaves the prM protein of the immature virus resulting in maturity. This maturation stage is sometimes incomplete, resulting in a mixture of virus particles with different stages of maturity. Virus particles exhibit conformational dynamics known as viral respiration. Virion maturation and respiration have an impact on antibody recognition so that it affects neutralization and enchancing activities.

Protein E is the main target for neutralizing antibodies, due to its location on the virion surface of a DENV. There are three domains, namely domains I (DI), II (DII) and III (DIII) in the E protein structure. Each DENV particle contains 180 E protein monomers that make up 90 E-dimers.

The neutralizing and ADE activity of the antibody was determined by the viral epitope. Antibodies targeting the fusion loop epitope (FLE) or bc loop in DII generally provide low neutralization, high ADE and have cross-reactivity to other flaviviruses. Antibodies like this are widely formed during secondary infection with DENV, because the epitope between flaviviruses is highly conserved. Antibodies bound to the E dimer, the epitope of the quaternary structure, or the hine region of DI-DIII provide high neutralization ability by inhibiting viral conformational changes and membrane fusion. Antibodies that recognize the epitope complex play a major role in the neutralizing activity that occurs in the patient's serum in the convalescent phase. However, some of these antibodies are specific to certain serotypes. Antibodies targeting domain III are serotype specific and exhibit higher neutralizing activity when compared to antibodies targeting domains I-II, however, antibodies targeting domain III are not widely produced in the human body.

Human monoclonal antibody (HuMAb) can be a useful tool to elucidate the mechanism of neutralization and ADE, as information needed in vaccine development. In addition, HuMAb can also be used for prophylactic and therapeutic purposes. Several researchers have succeeded in developing HuMAb by various methods.

However, therapeutic agents against flavivirus infection are not yet available. Seeing the success of antibody therapy against syncytium virus in the respiratory tract, Ebola virus and SARS-CoV-2 virus, antibody therapy against Dengue virus is promising. Using the newly developed cell technology, SPYMEG, we have succeeded in developing eight anti-DENV HuMAb clones from an acute-phase patient with secondary infection in Indonesia.

HuMAbs in this study have potential as therapeutic agents against dengue virus, especially against viral strains circulating in Southeast Asia, including Indonesia, as one of the largest dengue endemic countries in the world.

In general, HuMAbs with high neutralizing ability against Dengue virus are serotype-specific, bind to E-dimers or epitope quaternary structures, and inhibit at the pre- and post-adjacent stages of virus attachment to the host. On the other hand, HuMAbs with low neutralization ability were highly cross-reactive against all dengue virus serotypes, bound to the monomer E FLEs, and only inhibited at the pre-adhesion stage of the virus.

Although the HuMAbs produced in this study were HuMAbs type with low neutralization ability, all HuMAbs showed low NT50 values, especially against DENV-2. mOf the eight HuMAbs produced in our study, 3G9 showed superior properties over the others, namely:

1. Capable of inhibiting DENV-2 with an NT50 value of 100 times lower than 4G2 (a low neutralizing antibody bound to FLE). These results underline the potential use of 3G9 as a neutralizing antibody against Dengue virus. The presence of HuMAb with a high neutralization potential, particularly against DENV-2, is very advantageous. This is because the Dengue vaccine (CYD-TDV), as the only Dengue vaccine currently accepted for use, provides a low level of protection against DENV-2. In studies of people who have received CYD-TDV vaccination, it was reported that neutralizing cross-reactive antibodies play an important role in establishing protection against DENV-2, whereas serotype-specific neutralization is the key to protection against other DENV serotypes. Thus, the HuMAb generated in our study (3G9) would be able to make up for the shortage of currently available Dengue vaccines.

2. Not only against DENV, HuMAb 3G9 produced in this study was also able to neutralize other flaviviruses with an NT50 value of around 0.1 g/ml. ZIKV is generally less susceptible to FLE antibodies because of its high thermostability and less virion breathing. Thus, the presence of antibodies with neutralizing potential against DENV and ZIKV at the same time will be very promising, given that the two viruses circulate together in nature and the presence of ADE in infections caused by both DENV and ZIKV. Therefore, 3G9 has the opportunity to be applied as a therapeutic agent in the treatment of various mosquito-borne flavivirus infections.

3. Having a high somatic hyper-mutation rate in the variable region indicates affinity maturity. This is evidenced by the absence of the escape mutant virus even after 5 passages of Vero cells in the presence of HuMAb. Given the conserved usion loop among flaviviruses, it is certain that an escape mutation at this position will be lethal to the virus. These characteristics are also favorable for its development as a therapeutic.

4. Administration of the 3G9 antibody significantly prolongs the survival of interferon receptor /β/γ knockout in C57BL/6 mice exposed to lethal DENV.

5. Modified Fc-3G9 resulted in HuMAb without ADE activity, thus successfully demonstrating an increase in therapeutic potential in vivo and a strong ability to compete with an ADE-prone antibody in vitro.

In this study it can be concluded that 3G9 is a potential HuMAb with a FLE target. Modification of 3G9 in the Fc section shows its neutralization ability in vivo. This study also confirms the possibility of using affinity-matured FLE antibody as a therapeutic agent.

Source : news.unair.ac.id

Sourece of Picture : Istock{:}{:id}Beberapa virus yang ditularkan melalui nyamuk meliputi virus Dengue (DENV), Japanese encephalitis virus (JEV), West Nile virus (WNV), and Zika virus (ZIKV) termasuk dalam genus Flavivirus dan famili Flaviviridae. Diantara kesemuanya, DENV menyebabkan permasalahan kesehatan paling serius di dunia, terkait jumlah pasien dan tingkat fatalitas yang ditimbulkan. Infeksi yang diakibatkan oleh  salah satu serotipe DENV (1-4) menyebabkan Dengue fever (DF), Dengue hemorrhagic fever (DHF) atau Dengue shock syndrome (DSS). Setiap tahunnya, setidaknya tercatat 390 juta infeksi Dengue dengan 100 juta orang menunjukkan gejala dan 21.000 kematian di seluruh dunia.

Salah satu hipotesis mekanisme terjadinya resiko peningkatan derajat keparahan akibat infeksi DENV adalah antibody-dependent enhancement (ADE), yaitu dimana antibodi DENV yang telah ada pada tubuh seseorang baik yang ditimbulkan oleh infeksi primer maupun akibat vaksinasi akan memfasilitasi reseptor Fc-sel positif seperti makrofag apabila terjadi infeksi Dengue selanjutnya. Dengan demikian, antibodi DENV dapat memerankan dua aktifitas yang saling bertentangan yaitu netralisasi dan ADE. Netralisasi menekan viremia sehingga menghasilkan pertahanan terhadap infeksi DENV. Sementara ADE meningkatkan viremia, yang berhubungan dengan peningkatan keparahan akibat infeksi Dengue. Fenomena ini kemungkinan akan meningkatkan resiko peningkatan derajat keparahan apabila terjadi infeksi Dengue pada orang seronegatif yang telah menerima vaksinasi CYD-TDV, sebagai satu-satunya vaksin Dengue yang terlisensi saat ini. Selain itu, antibodi ZIKV juga dilaporkan terbukti dapat meningkatkan infeksi Dengue secara in vitro begitu pula sebaliknya. Adanya ADE memperumit patogenesis Dengue, menjadi masalah tersendiri bagi pengembangan vaksin Dengue yang efektif,  maupun bagi pembuatan antibodi profilatik atau terapetik.

Genom virus Dengue mengkode tiga protein struktural yaitu capsid [C], premembrane/membrane [prM/M], dan envelope [E] serta tujuh protein non-structural). Partikel virus terhimpun di lumen retikulum endoplasma, dimana nukleokapsid (RNA virus membentuk kompleks dengan protein C) tergabung kedalam lipid bilayer yang mengandung protein prM dan E. Karena lalu lintas partikel virus yang belum matang melalui jaringan trans-Golgi, sebuah serine protease (furin) dari host memecah protein prM dari virus yang belum matang menghasilkan kematangan. Tahap pematangan ini terkadang berlangsung tidak lengkap sehingga menghasilkan sebuah campuran partikel virus dengan tahap kematangan yang berbeda-beda. Partikel virus menunjukkan dinamika konformasional yang dikenal sebagai pernafasan virus. Kematangan dan pernafasan virion berdampak pada pengenalan antibodi sehingga mempengaruhi aktivitas netralisasi dan enchancing.

Protein E adalah target utama antibodi dengan kemampuan netralisasi, karena letaknya yang berada pada permukaan virion sebuah DENV. Terdapat tiga domain yaitu domain I (DI), II (DII) dan III (DIII) pada struktur protein E. Setiap partikel DENV mengandung 180 monomer protein E yang membentuk 90 E-dimer.

Aktivitas netralisasi dan ADE dari antibodi ditentukan oleh epitop virus. Antibodi yang menargetkan fusion loop epitope (FLE) atau bc loop pada DII umumnya memberikan netralisasi yang rendah, ADE  yang tinggi dan memiliki reaktivitas silang terhadap flavivirus lainnya. Antibodi seperti ini secara luas terbentuk saat infeksi sekunder DENV, karena epitop diantara Flavivirus sangat conserved. Antibodi yang terikat pada dimer E, epitop struktur kuartener, atau daerah hine DI-DIII menghasilkan kemampuan netralisasi yang tinggi dengan cara menghambat perubahan konformasi virus dan fusi membran. Antibodi yang mengenali kompleks epitop berperan besar dalam aktivitas netralisasi yang terjadi di serum pasien pada fase konvalesen. Namun demikian, beberapa antibodi tersebut bersifat spesifik terhadap serotipe tertentu. Antibodi-antibodi yang menargetkan domain III bersifat spesifik terhadap serotipe tertentu dan menunjukkan aktivitas netralisasi yang lebih tinggi bila dibandingkan dengan antibodi yang menargetkan domain I-II, namun antibodi dengan target domain III tidak banyak diproduksi di dalam tubuh manusia.

Human monoclonal antibody (HuMAb) dapat menjadi alat yang berguna untuk menjelaskan mekanisme netralisasi dan ADE, sebagai informasi yang dibutuhkan pada pengembangan vaksin. Selain itu, HuMAb dapat pula digunakan untuk tujuan profilatik dan terapetik. Beberapa peneliti telah berhasil mengembangkan HuMAb dengan berbagai metode.

Walaupun begitu, agen terapetik terhadap infeksi Flavivirus belum tersedia hingga saat ini. Melihat keberhasilan terapi antibodi terhadap virus sinsitium di saluran pernafasan, virus Ebola dan virus SARS-CoV-2, terapi antibodi terhadap virus Dengue menjadi hal yang menjanjikan. Dengan menggunakan teknologi sel yang baru dikembangkan, SPYMEG, kami pun berhasil mengembangkan delapan klon HuMAb anti-DENV dari seorang pasien fase akut akibat infeksi sekunder di Indonesia.

HuMAbs pada penelitian ini potensial sebagai agen terapetik terhadap virus Dengue, terutama terhadap strain virus yang bersirkulasi di wilayah Asia Tenggara termasuk Indonesia, sebagai salah satu negara endemis Dengue terbesar di dunia.

Secara umum, HuMAbs dengan kemampuan netralisasi tinggi terhadap virus Dengue bersifat spesifik terhadap serotipe tertentu, terikat pada E-dimer atau struktur kuartener epitope, dan menghambat  pada tahap pre- dan post- penempelan virus pada host. Sebaliknya, HuMAbs dengan kemampuan netralisasi rendah akan sangat cross-reactive terhadap semua serotipe virus Dengue, terikat pada monomer E FLEs, dan hanya menghambat pada tahapan pre-penempelan virus.

Walaupun HuMAbs yang dihasilkan pada penelitian ini adalah tipe HuMAbs dengan kemampuan netralisasi rendah, namun kesemua HuMAb menunjukkan nilai NT50 yang rendah, khususnya terhadap DENV-2. mDari kedelapan HuMAb yang dihasilkan dalam penelitiankami, 3G9 menunjukkan sifat lebih unggul dibandingkan lainnya, yaitu :

1. Mampu menghambat DENV-2 dengan nilai NT50 100 kali lebih rendah dibandingkan dengan 4G2 (sebuah antibodi rendah netralisasi yang terikat pada FLE). Hasil ini menggarisbawahi akan  potensi penggunaan 3G9 sebagai antibodi penetralisasi terhadap virus Dengue. Adanya HuMAb dengan potensi netralisasi yang tinggi, khususnya terhadap DENV-2, sangat menguntungkan. Hal ini karena vaksin Dengue (CYD-TDV), sebagai satu-satunya vaksin Dengue yang diterima penggunaannya saat ini, memberikan tingkat perlindungan yang rendah terhadap DENV-2. Pada studi terhadap orang yang telah menerima vaksinasi CYD-TDV, dilaporkan bahwa antibodi dengan netralisasi yang bersifat cross-reactive memegang peran penting dalam membentuk perlindungan terhadap DENV-2, sedangkan netralisasi yang bersifat serotype-specific adalah kunci perlindungan terhadap serotipe DENV lainnya. Dengan demikian, HuMAb yang dihasilkan dalam penelitian kami (3G9) akan mampu melengkapi kekurangan vaksin Dengue yang tersedia saat ini.
2. Tidak hanya terhadap DENV, HuMAb 3G9 yang dihasilkan dalam penelitian ini juga mampu mentralisasi Flavivirus lainnya dengan nilai NT50 sekitar 0.1 μg/ml. ZIKV umumnya kurang susceptible terhadap antibodi FLE karena tingginya termostabilotasnya dan sedikitnya virion breathing. Sehingga keberadaan antibodi dengan potensi netralisasi terhadap DENV dan ZIKV sekaligus akan menjadi sangat menjanjikan, mengingat bahwa kedua virus tersebut bersirkulasi bersama di alam serta adanya ADE pada infeksi yang diakibatkan baik oleh DENV maupun ZIKV. Oleh karena itu, 3G9 berpeluang untuk dapat diaplikasikan sebagai terapetik dalam pengobatan berbagai infeksi flavivirus yang ditularkan oleh nyamuk.
3. Memiliki sebuah laju somatic hyper-mutation yang tinggi pada variable region  megindikasikan kematangan afinitas. Hal ini dibuktikan dengan tidak terbentuknya escape mutant virus bahkan setelah 5 kali passage sel Vero dengan keberadaan HuMAb. Mengingat usion loop yang conserved diantara Flavivirus, maka bisa dipastikan bahwa sebuah escape mutation pada posisi ini akan mematikan terhadap virus. Karakteristik ini juga menguntungkan bagi pengembangannya sebagai terapetik.
4. Pemberian antibodi 3G9 secara signifikan memperpanjang kelangsungan hidup knockout reseptor interferon α/β/γ pada tikus C57BL/6 yang telah dipapar dengan DENV yang mematikan.
5. Modifikasi Fc-3G9 menghasilkan HuMAb tanpa aktivitas ADE sehingga berhasil menunjukkan adanya peningkatan potensi terapetik secara in vivo dan kemampuan kuat bersaing dengan sebuah antibodi prone-ADE secara in vitro.

Pada penelitian ini dapat disimpulkan bahwa 3G9 merupakan HuMAb potensial dengan target FLE. Modifikasi 3G9 pada bagian Fc memperlihatkan kemampuan netralisasinya secara in vivo. Penelitian ini juga mengkonfirmasi peluang penggunaan affinity-matured antibodi FLE sebagai agen terapetik.

Sumber : News.unair.ac.id

Sumber Gambar : IStock{:}